HPLC
De Viquipèdia
La Cromatografia líquida d'alta ressolució o High performance liquid chromatography (HPLC) és un tipus de cromatografia en columna utilitzada freqüentment en bioquímica i química analítica. També se l'anomena a vegades Cromatografia líquida d'alta pressió o High pressure liquid chromatography (HPLC), encara que aquesta terminologia es considera antiga i està en desús. L'HPLC és una tècnica utilitzada per separar els components d'una mescla basant-se en diferents tipus d'interaccions químiques entre les substàncies compostzades i la columna cromatogràfica.
Taula de continguts |
[edita] Principal
En l' HPLC isocràtica el compost passa per la columna cromatogràfica a través de la fase estacionària (normalment, un cilindre amb petites partícules arrodonides amb certes característiques químiques a la seva superfície) mitjançant el bombeig de líquid (fase mòbil) a alta pressió a través de la columna. La mostra a compostzar és introduïda en petites quantitats i els seus components es retarden diferencialment depenent de les interaccions químiques o físiques amb la fase estacionària a mesura que avancen per la columna. El grau de retenció dels components de la mostra depèn de la naturalesa del compost, de la composició de la fase estacionària i de la fase mòbil. El temps que tarda un compost a ser eluït de la col·lumna s'anomena temps de retenció i es considera propietat identificativa característica del compost en una determinada fase mòbil i estacionària. La utilització de pressió en aquest tipus de cromatografies incrementa la velocitat linial dels compostos dins la col·lumna i redueix així la difusió dels compostos dins la col·lumna i millora la resolució de la cromatografia. Els dissolvents més utilitzats són l'aigua, el metanol i l'acetonitril. L'aigua pot contenir tampons, sals, o compostos com l'àcid trifluoroacètic, que ajuden a la separació dels compostos.
Una millora introduïda a la tècnica d'HPLC descrita és la variació de la composició de la fase mòbil durant l'anàlisi, coneguda com "elució en gradient". Un gradient normal en una cromatografia de fase reversa pot començar a un 5% d'acetonitril i progressar de forma linial fins a un 50% en 25 minuts. El gradient utilitzat varia en funció de la hidrofobicitat del compost. El gradient separa els componenents de la mostra com una funció de l'afinitat del compost per la fase mòbil utlitzada respecte a l'afinitat per la fase estacionària. En l'exemple, utilitzant un gradient aigua/acetonitril els compostos més hidrofílics eluiran a major concentració d'aigua, mentre que els compostos més hidrofòbics eluiran a concentracions elevades d'acetonitril. Sovint, cal realitzar una sèrie de proves prèvies per tal d'optimitzar el gradient de manera que permeti una bona separació dels compostos.
[edita] Tipus de HPLC
[edita] Cromatografia de fase normal
La cromatografia de fase normal o "Normal phase HPLC" (NP-HPLC) va ser el primer tipus de sistema HPLC utilitzat en el camp de la química, i es caracteritza per separar els compostos en base a la seva polaritat. Aquesta tècnica utilitza una fase estacionària polar i una fase mòbil apolar, i s'utilitza quan el compost d'interès és força polar.
El compost polar s'associa i és retingut per la fase estacionària. La força d'adsorció augmenta a mesura que augmenta la polaritat del compost i la interacció entre el compost polar i la fase estacionària polar (en comparació a la fase mòbil) augmenta el temps de retenció. La força d'interacció no només depèn dels grups funcionals de el compost, sinó també en factors estèrics de manera que els isòmers estructurals sovint es poden diferenciar l'un de l'altre. La utilització de dissolvents més polars en la fase mòbil disminueix el temps de retenció dels compostos mentre que els dissolvents més hidrofòbics tendeixen a augmentar el temps de retenció.
La NP-HPLC va caure en desús als anys setanta amb el desenvolupament de l'HPLC de fase reversa o Reversed-phase HPLC a causa de la falta de reproductibilitat dels temps de retenció ja que els dissolvents pròtics canviaven l'estat d'hidratació de la silica o alumina de la cromatografia.
[edita] Cromatografia de fase reversa
L'HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consisteix en una fase immbòbil apolar i una fase mòbil de polaritat moderada. Una de les fases estacionàries més comuns d'aquest tipus de cromatografia és la silica tractada amb RMe2SiCl, on la R es una cadena alquil tal com C18H37 o C8H17. El temps de retenció és major per a les molècules de naturalesa apolar, mentre que les molècules de caràcter polar elueixen més ràpidament. El temps de retenció augmenta amb l'addició de dissolvent polar a la fase mòbil i disminueix amb la introducció de dissolvents més hidrofòbics. La cromatografia de fase reversa és tant utlitzada que sovint se l'anomena HPLC sense cap més especificació.
La cromatografia de fase reversa es basa en el principi de les interaccions hidrofòbiques que resulten de les forces de repulsió entre un dissolvent relativament polar, un compost relativament apolar, i una fase estacionària apolar. La força conductora en la unió del compost a la fase estacionària és la disminució de l'àrea del segment apolar del compost exposat al dissolvent.. Aquest efecte hidrofòbic està dominat per la disminució de l'energia lliure de l'entropia associada amb la minimització de la interfase compost-dissolvent polar. L'efecte hidrofòbic disminueix amb l'addició de dissolvent apolar a la fase mòbil. Això modifica el coeficient de partició de manera que el compost es mou per la columna i elueix.
Les característiques del compost juguen un paper molt important en la retenció. En general, un compost amb una cadena alquil llarga s'associa amb un temps de retenció major perquè augmenta la hidrofobicitat de la molècula. Tanmateix, les molècules molt grans poden veure reduïda la interacció entre la superfície del compost i la fase estacionària. El temps de retenció augmenta amb l'àrea de superfície hidrofòbica que sol ser inversament proporcional a la mida del compost. Els compostos ramificats solen eluir més ràpidament que els seus isòmers linials ja que la superfície total es veu reduïda.
A part de la hidrofobicitat de la fase mòbil, altres modificacions de la fase mòbil poden afectar la retenció del compost; per exemple, l'addició de sals inorgàniques provoca un augment linial en la tensió superficial, i com que l'entropia de la interfase compost-dissolvent està controlada precisament per la tensió superficial, l'addició de sals tendeix a augmentar el temps de retenció. Una altra variable important és el pH ja que pot canviar la hidrofobicitat del compost. Per aquest motiu, la majoria de mètodes utilitzen un tampó com el fosfat de sodi per controlar el valor del pH. Aquests tampons controlen el pH, però també neutralitzen la càrrega o qualsevol reste de silica de la fase estacionària que hagi quedat exposada i actuen com a contraions que neutralitzen la càrrega de l'compost. L'efecte dels tampons sobre la cromatografia pot variar, però en general milloren la separació cromatogràfica.
Les columnes de fase reversa es fan malbé en menys facilitat en comparació amb les columnes de silica normals. Tanmateix, moltes columnes de fase reversa estan formades per silica modificada amb cadenes alquil i no s'han d'utilitzar mai amb bases en medi aquós ja que aquestes podrein danyar l'esquelet de silica subjacent. Les columnes es poden utilitzar en acids en medi aquós però no haurien d'estar exposades massa temps a l'àcid perquè pot corrosionar les parts metàl·liques de l'aparell d'HPLC.
[edita] Cromatografia d'exclusió mol·lecular
La cromatografia d'exclusió molecular, també coneguda com cromatografia per filtració en gel, separa les partícules de la mostra en funció de la seva mida. Generalment es tracta d'una cromatografia de baixa resolució de manera que se sol utilitzar en els passos finals del procés de purificació. També és molt útil per a la determinació de l'estructura terciària i l'estructura quaternària de les proteines purificades.
[edita] Cromatografia de bescanvi iònic
En la cromatografia de bescanvi iònic, la retenció es basa en l'atracció electrostàtica entre els ions en solució i les càrregues immobilitzades a la fase estacionària. Els ions de la mateixa càrrega són exclosos mentre que els de càrrega oposada són retinguts per la col·lumna. Alguns tipus d'intercanviadors iònics són: i) Resines de poliestirè, ii) interncanviadors iònics de cel·lulosa i dextrans (gels) i iii) Silica porosa o vidre de mida de porus controlada. En general els intercanviadors iònics afavoreixen la unió de ions d'alta càrrega i radi petit. Un increment en el concentració del contraió (respecte als grups funcionals de la resina) redueix el temps de retenció. Un increment en el pH redueix el temps de retenció en les cromatografies de bescanvi catiònicm mentre que una disminució del pH redueix el temps de retenció en les cromatografies de bescanvi aniònic.
Aquest tipus de cromatografia és ampliament utilitzat en les següents aplicacions: purificació d'aigua, concentració de components traça, Ligand-exchange chromatography, Ion-exchange chromatography of proteins, High-pH anion-exchange chromatography of carbohydrates and oligosaccharides, etc.
[edita] Cromatografia basada en bioafinitat
Aquest tipus de cromatografia es basa en la capacitat de substàncies biològicament actives de formar complexos estables, específics i reversibles. La formació d'aquests complexes implica la participació de forces moleculars com les interaccions de Van der Waal, interaccions electrostàtiques, interaccions dipol-dipol, interaccions hidrofòbiques i ponts d'hidrogen entre les partícules de la mostra i la fase estacionària.
[edita] Paràmetres
[edita] Diàmetre intern
El diàmetre intern d'una columna d'HPLC és un aspecte crític que determina la quantitat de mostra que es pot carregar a la columna i també influeix en la seva sensibilitat. Les columnes de diàmetre intern més gran (>10 mm) s'utilitzen normalment en la purificació de compostos per a la seva utilització posterior. En canvi, les columnes de diàmetre intern menor (4-5 mm) s'utilitzen en l'anàlisi quantitatiu de les mostres, i es caracteritzen per l'augment la sensibilitat i la minimització del consum de dissolvents que comporten. Aquestes columnes se solen anomenar columnes d'escala analítica i normalment estan associades a un detector UV-vis. A part, existeixen altres tipus de columnes, com les de tipus capil·lar, amb un diàmetre inferior a 0.3 mm, utilitzades principalment en espectrometria de masses.
[edita] Mida de les partícules
La majoria d'HPLC tradicionals es realitzen amb una fase estacionària unida a l'exterior de partícules esfèriques de silica. Aquestes partícules poden tenir diferents mides, sent les de 5μm de diàmetre les més utilitzades. Partícules més petites ofereixen una major superfície i una millor separació, però la pressió que es requereix per obtenir una velocitat linial òptima augmenta de forma inversament proporcional al cub del diàmetre de la partícula. Això significa que disminuir la mida de les partícules a la meitat, augmentaria la resolució de la columna, però alhora, augmentaria la pressió necessària en un factor de vuit.
[edita] Mida de porus
Moltes fases estacionàries són poroses per proporcionar una major superfície. Els poros petits proporcionen una major superfície mentre que els poros de major mida proporcionen una cinètica millor, especialment per als composts de mida més gran; per exemple, una proteïna que sigui lleugerament més petita que la mida de poros hi pot entrar, però dificilment en sortirà amb facilitat.
[edita] Pressió de la bomba
La pressió de les bombes és variable segons el model i fabricant, però el seu rendiment es mesura en llur habilitat per generar un flux constant i reproduïble. La pressió pot assolir valors de fins a ~40 MPa (o unes 400 atmosferes). Els aparells més moderns d'HPLC incorporen millores per poder treballar a pressions més altes i, per tant, poder utilitzar partícules de mida més petita a les columnes (< 2 micròmetres). Aquests nous aparells, anomenats "Ultra Performance Liquid Chromatography" (UPLC) poden treballar amb valors de fins a ~100 MPa de pressió (unes 1000 atmosferes). (Cal tenir en compte que les sigles "UPLC" són una marca registrada de Waters Corporation encara que a vegades s'utilitzen de forma general per a designar aquest tipus d'aparells.)
[edita] Fabricants d'aparells d'HPLC
- Agilent Technologies [1] (antigament Hewlett-Packard)
- Beckman Coulter, Inc. [2]
- Dionex Corporation [3]
- Eksigent Technologies [4]
- Gilson, Inc. [5]
- Micro-Tech Scientific [6]
- PerkinElmer, Inc. [7]
- Proxeon Biosystems A/S [8]
- Shimadzu Scientific Instruments [9]
- Thermo Electron Corporation [10]
- Varian, Inc.[11]
- Waters Corporation [12]
[edita] Fabricants de col·lumnes d'HPLC i accessoris
- Agilent Technologies
- Beckman Coulter, Inc. [13]
- Dionex Corporation [14]
- Eksigent Technologies [15]
- Gilson, Inc. [16]
- Hitachi [17]
- Isolation Technologies [18]
- Micro-Tech Scientific [19]
- Phenomenex [20]
- Proxeon Biosystems A/S [21]
- Shimadzu Scientific Instruments
- Sielc
- Supelco
- Thermo Electron Corporation [22]
- Tosoh Corporation [23]
- Varian, Inc.
- Waters Corporation [24]
[edita] Veure també...
- Cromatografia
- Cromatografia de bescanvi iònic
- Cromatografia d'exclusió molecular
